細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>

1、掌屋凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征 
　　2、學(xué)會用熒光探針對細(xì)胞進(jìn)行雙標(biāo)記來檢測正常活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的方法

二、實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞死亡根據(jù)其性質(zhì)、起源及生物學(xué)意義區(qū)分為凋亡和壞死兩種不同類型。凋亡普遍存在于生命界，在生物個體和生存中起著非常重要的作用。它是細(xì)胞在一定生理?xiàng)l件下一系列順序發(fā)生事件的組合，是細(xì)胞遵循一定規(guī)律自己結(jié)束生命的自主控制過程。細(xì)胞凋亡具有可鑒別的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征。

在形態(tài)上可見凋亡細(xì)胞與周圍細(xì)胞脫離接觸，細(xì)胞變園，細(xì)胞膜向內(nèi)皺縮、胞漿濃縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、細(xì)胞核固縮破裂呈團(tuán)塊狀或新月狀分布、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜進(jìn)一步融合將細(xì)胞分成多個完整包裹的凋亡小體，凋亡小體zui后被吞噬細(xì)胞吞噬消化。在凋亡過程中細(xì)胞內(nèi)容物并不釋放到細(xì)胞外，不會影響其它細(xì)胞，因而不引起炎癥反應(yīng)。

在生物化學(xué)上，多數(shù)細(xì)胞凋亡的過程中，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶活化，活性增加。核DNA隨機(jī)地在核小體的連接部位被酶切斷，降解為180-200bp或它的整倍數(shù)的各種片斷。如果對核DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳，可顯示以180-200bp為基數(shù)的DNA ladder（梯狀帶紋）的特征。

相比之下，壞死是細(xì)胞處于劇烈損傷條件下發(fā)生的細(xì)胞死亡。細(xì)胞在壞死早期即喪失質(zhì)膜完整性，各種細(xì)胞器膨脹，進(jìn)而質(zhì)膜崩解釋放出其中的內(nèi)容物，引起炎癥反應(yīng)，壞死過程中細(xì)胞核DNA雖也降解，但由于存在各種長度不等的DNA pian斷，不能形成梯狀帶紋，而呈彌散狀。

一些溫和的損傷刺激及一些抗腫瘤藥物可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，通常這些因素在誘導(dǎo)凋亡的同時，也可產(chǎn)生細(xì)胞壞死，這取決于損傷的劇烈程度和細(xì)胞本身對刺激的敏感程度。

三尖杉酯堿（HT）是我國自行研制的一種對急性粒細(xì)胞白血病，急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范圍內(nèi)作用2小時，即可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，并表現(xiàn)出典型的凋亡特征。本實(shí)驗(yàn)用1μg/ml HT在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時也有少數(shù)細(xì)胞發(fā)生壞死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）對細(xì)胞進(jìn)行雙重染色，可以區(qū)別凋亡、壞死及正常細(xì)胞。

細(xì)胞膜是一選擇性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿過質(zhì)膜。當(dāng)細(xì)胞壞死時，質(zhì)膜不完整，PI就進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，它可嵌入到DNA或RNA中，使壞死細(xì)胞著色，凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞不著色。而一些活細(xì)胞染料由于為親脂性物質(zhì)，可跨膜進(jìn)入活細(xì)胞，因而可進(jìn)行活細(xì)胞染色。Hoechst33342是一種活性熒光染料且毒性較弱，它是雙苯并咪唑的一種衍生物。與DNA特異結(jié)合（主要結(jié)合于A-T）堿基區(qū)），顯示凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞。凡是看到有凋亡小體的細(xì)胞都是凋亡細(xì)胞。

三、實(shí)驗(yàn)用品

1、試劑：三尖杉酯堿（HT），300μg/ml，100mmol/L Tris-HCl（pH7.5），5mol/L EDTA緩沖液、堿性裂解液：0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸鈉：3mol/L KAc（pH4.8）；異丙醇；70%乙醇；溴酚藍(lán)，蔗糖指示劑。TBE電泳緩沖液，1%瓊脂糖，溴乙錠。PI母液：500μg/ml；Ho33342母液：2mmol/L。 
　　2、儀器設(shè)備：熒光顯微鏡，電泳儀，電泳槽，微量加樣器（1ml，100μl）0.5、1.5ml離心管，載玻片，蓋玻片。

四、實(shí)驗(yàn)材料

人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。

五、方法步驟

1、三尖杉酯堿誘發(fā)HL-60細(xì)胞凋亡 
　　（1）實(shí)驗(yàn)前約24小時，接種兩瓶HL-60細(xì)胞，標(biāo)記①、②，每瓶含約6ml培養(yǎng)液，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 
　　（2）實(shí)驗(yàn)前約2.5小時，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%，①號瓶加入三尖杉酯堿200μl，使終濃度為1μg/ml，②號瓶中加入同等量PBS（pH7.4）作對照。共同放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2.5小時。

2、Ho33342和PI雙重染色鑒別三種細(xì)胞 
　　（1）染色：將瓶中的細(xì)胞搖勻取200μl于1.5ml的離心管中，加入Ho33342母液2μl，PI 20μl，染色15分鐘。 
　　（2）滴片：取一載玻片用雙面膠圍成一小室，從離心管中各取以上染色后的細(xì)胞懸液10μl，加入小室內(nèi)蓋上蓋玻片，熒光鏡下用紫外激發(fā)光，高倍鏡下觀察，區(qū)別三種細(xì)胞，并注意三者比例。

六、注意事項(xiàng)

1、誘導(dǎo)培養(yǎng)HL-60細(xì)胞時間要準(zhǔn)確；
　　2、熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞時，由于熒光易碎滅，觀察時要盡量快。